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免疫物材极性解离净化小鼠内部构体胞材

发布时间:08-05  
主要试剂和仪器C小鼠脾脏淋巴细胞悬液制备颈椎脱臼法处死小鼠,无菌分离小鼠脾脏放于冷Hanks液中,剪碎并反复碾磨通过200目的无菌铜网,收集悬液用红细胞溶解液去除红细胞,再用大量Hanks液洗涤细胞2次,1200rmin离心10min,用含有100mLL小牛血清的RPMI1640培养液重悬,计数。
MACS纯化CD8+T细胞取4107细胞,1200rmin离心10min,去上清液后用160L缓冲液重悬,加40L抗体Cocktail充分混匀,4孵育10min;加160L缓冲液,1200rmin离心10min,去上清液,再加入320L缓冲液,80L磁性微珠,充分混匀,4孵育15min;用适量缓冲液冲洗,1200rmin离心10min;吸除上清液,用500L缓冲液重悬细胞,200目筛网过滤成无气泡的单细胞悬液;将MS细胞分离柱置于MACS磁力架上,先用500L缓冲液洗柱,再将细胞悬液通过MS柱,1500L缓冲液洗涤,收集流出液体;离心收集细胞,计数。
分离前后CD8+T细胞纯度检测及得率计算分别取上述经MACS分离前后的细胞1105,1200rmin离心10min,弃上清液,加入PBS100L及PE-Cy5标记的抗小鼠CD3e单抗、FITC标记的抗小鼠CD8单抗各1L(同时设立同型对照),混匀,4避光孵育60min后,洗涤2次后重悬于500LPBS,FACSCalibur流式细胞仪检测。BDFACS专用Cellquest3.0软件分析。得率(%)=(分离后细胞总数分离后阳性细胞率)/(分离前细胞总数分离前阳性细胞率)100%1.6细胞活力检测将4gL台盼蓝和分离前后的106mL-1CD8+T细胞按19体积比充分混匀后,取10L加入细胞计数板中,3min内镜下观察,死细胞被染成淡蓝色,而活细胞拒染。活细胞率(%)=活细胞总数(活细胞总数+死细胞总数)100%.
细胞增殖检测将分离后的CD8+T细胞调整细胞数为107mL-1,加入CFSE使其终浓度为2molL的,迅速混匀,37避光孵育10min,PBS清洗3次,用RPMI1640完全培养液重悬,调整细胞数为106mL-1.实验组加入ConA刺激使其终质量浓度为5gmL,对照组则不加ConA刺激。37培养72h后,流式细胞仪检测细胞增殖情况。
结果MACS负性分离前后CD8+T细胞的纯度以及得率分析MACS法分离小鼠CD8+T细胞,流式细胞仪检测细胞纯度达到(91.63.6)%,而分离前混合细胞中CD8+T细胞的比例为(9.53.4)%。分离前后CD8+T细胞的比例显著提高(P0.05.
细胞增殖测定对分离后的小鼠CD8+T细胞用CFSE进行标记,ConA刺激72h后流式细胞仪检测。CFSE能进入活细胞中,随细胞的分裂而平均分配到子代细胞中。当用流式细胞仪激发时,可以检测到荧光信号,当细胞分裂一次时,荧光强度减半。如a所示,当细胞不用ConA刺激,72h后流式细胞图基本表现为单一的荧光峰M1,说明细胞没有发生增殖。b中,M1为没有发生增殖的细胞,比例占总细胞数的(43.72.1)%,M2为分裂一次的细胞,比例占总细胞数的(32.31.4)%,M3为分裂两次的细胞,比例占总细胞数的(24.01.9)%.可见细胞在分离后保持了良好的活性,能对外源刺激表现出很好的反应性。
讨论目前常用的CD8+T细胞分离方法有尼龙毛柱分离法、补体分离法、流式分选等。尼龙毛柱分离法是依靠细胞的选择性黏附特性,而达到纯化T细胞的目的。此法成本较低,简便易行,无需特殊设备,但是回收率和细胞纯度低。补体分离法的原理是借助免疫细胞表面抗原和相应抗体结合后,再加入补体,产生补体介导的细胞毒性反应,来去除抗原阳性的细胞。但是该方法去除细胞的效率也不高,且需要与其它方法联合应用,步骤繁琐。流式分选是借助流式细胞仪,对结合有荧光抗体的细胞进行分离。
该方法分离效率高,但对无菌要求严格,并且需要借助昂贵的仪器,故在一定程度上限制了该方法的应用。更为重要的是,要研究CD8+T细胞的功能,如CD8+T细胞的活化信号转导、增殖、细胞因子分泌、调亡等研究,必须避免细胞表面与抗体交连,才能使其功能不受影响,研究结果可靠。
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